שְׁאֵלָה:
איך מדמיינים RNA על ג'ל?
Superbest
2014-10-08 04:57:33 UTC
view on stackexchange narkive permalink

ניהלתי תגובת שעתוק חוץ גופית והפקתי רנ"א ממין יחיד ובגודל מוגדר. ברצוני לדמיין זאת כדי לבדוק אם התגובה הצליחה.

האם אוכל לעשות זאת על ג'ל אגרוזה? האם זה פשוט להכין ג'ל TAE-agarose 1% עם EtBR שתשתמש בו לצורך אלקטרופורזה שגרתית של DNA, ולהפעיל זאת? האם יש צורך לנקוט באמצעים מיוחדים כנגד RNAs אפשריים בג'ל או במאגר הריצה?

כלול בג'ל האגרוז שלך 4% אקונומיקה ביתית כדי לעכב רנזות. זוהי אלטרנטיבה הרבה יותר קלה ל- PFA ויעילה באותה מידה.
שתיים תשובות:
Chris
2014-10-08 20:47:16 UTC
view on stackexchange narkive permalink

יש לך שתי אפשרויות: כאשר אתה זקוק רק לבדיקה מהירה אם ה- RNA שלך תקין ואכן אתה מקבל רק פס אחד, אתה יכול לנסות שיטה "מהירה ומלוכלכת". מחממים את הדגימה למשך 5 דקות בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס ואז מקררים אותה מייד במרחץ קרח ושומרים אותה שם עד להעמסה. בכך אתה ממיס את המבנה המשני של ה- RNA ושומר אותו במצב זה. סביר להניח שתראה רק רצועה אחת.

אם זה לא עובד או אם אתה רוצה להשתמש בסמן בגודל RNA, אין דרך לעקוב מפחית ג'ל אלקטרופורזה. כאן אתה מנטרל את הדגימה שלך במאגר הטעינה ואז מפעיל ג'ל דנטורציה שמונע את המבנים המשניים. יש מאמר טוב על כך:

השיטה הקלאסית המשתמשת בפורמלדהיד (אשר מסוכן יותר בטיפול) מתואר במאמר הבא וגם בספר "שיבוט מולקולרי: מדריך מעבדה" מאת מניאטיס ועמיתיו:

Superbest
2014-10-08 04:57:33 UTC
view on stackexchange narkive permalink

RNA ניתן לקיפול, מה שמייצר מבנה משני ומשנה את הניידות שלו (בהשוואה ל- DNA בעל גליון-על). לכן, אם לא תשלול את ה- RNA שלך כראוי, אפילו מין אחד יפיק מריחה.

אסטרטגיה נפוצה היא לשלב כימיקלים דנטורינגיים כמו פורמלדהיד בהליך. ראה פרוטוקול Life Technologies זה.

ככל הנראה, אתה יכול גם להכין ג'ל DNA סטנדרטי עם אקונומיקה נוספת. לא השתמשתי בטכניקה זו, אך יש להן כמה תוצאות לדוגמא.

אני משתמש בג'ל אגרוז 1% לא מתנדב עם אתידיום ברומיד. אני משתמש ב- [Better Faster Media] טוב יותר (http://www.fasterbettermedia.com/) מאגר LB כדי שאוכל להפעיל מתח גבוה ולבצע את הג'לים שלי מהר יותר. בדרך כלל אני רואה 2 גומיות על הג'ל בגלל מבנה משני של RNA, אך ניתן לתקן זאת על ידי חימום זה ל 65C למשך 5 דקות, ואחריו צינון על קרח במשך 5 דקות. ה- RNA שלי עשוי להיות שונה משלך, כך שאולי לא תוכל להשיג להקה אחת עם הטריק הזה. מה שלא הצלחתי לעשות זה להריץ סולם RNA על ג'ל שאינו מטפל, אבל לא ממש ניסיתי כל כך קשה.


שאלה ותשובה זו תורגמה אוטומטית מהשפה האנגלית.התוכן המקורי זמין ב- stackexchange, ואנו מודים לו על רישיון cc by-sa 3.0 עליו הוא מופץ.
Loading...