שְׁאֵלָה:
מהו פרוטוקול מיניפרפ טוב לחדר הכיתה?
shigeta
2011-12-15 04:39:07 UTC
view on stackexchange narkive permalink

אני מנסה למצוא פרוטוקול טוב למיני-פרפסים של פלסמיד ואני מסתכל על 3 קפיצות שמצאתי:

  1. שימוש בפנול / כלורופורם
  2. עם פנול: כלורופורם: איזואמיאלכוהול,
  3. משקעים איזופרופנול, 12,000 גרם סיבוב למטה,
  4. שטפו עם אתנול קר של 70%.
  5. שימוש בליזוזים
    • ליס עם ליזוזים,
    • הסר גלולה,
    • משקעים איזופרופנוליים,
    • שטפו עם אתנול קר 80%.
  6. שימוש בפירוק אלקליין
    • פתוח תאים עם 80% גלוקוז במאגר EDTA,
    • להוסיף SDS ו- NaOH,
    • חלבון גלולה / קרום עם חומצה אצטית / אצטט,
    • משקעים של איזפרופנול,
    • לשטוף עם אתנול קר של 70%.

כולם נבדלים באופן כיצד לפרוץ את התאים ולהפריד בין פלסמידים לשאר התא. - לא מעט. מישהו יכול לעזור לי להבין איזה פרוטוקול הכי טוב כאן?

האם אתה בטוח שאתה רוצה שתלמידים ישתמשו בפנול? רוב המעבדות כנראה משתמשות בערכות להפקת DNA (למשל Quiagen MiniPrep). זה הרבה יותר קל וגם בטוח יותר.
אני הולך לסמן את התשובה של רבן כטובה ביותר מכיוון שהיא עוזרת לי לבחור ביותר מבין הפרוטוקולים. אבל תודה שציינת עד כמה ערכות הצ'יגן זולות - חשבתי שהן גרועות בהרבה. אתה כן לומד משהו באמצעות פרוטוקול, אבל העמודים הם קלים!
לידיעתך בעוד שזה נכון בערך $ 1-2 לפרה עבור עמודות ספין, אך עלות המגיב עבור SDS / NaOH היא כ 40 סנט להכנה. אתה צריך לעשות מעל 100 קפיצות כדי לראות את החיסכון.
רק רציתי לעדכן שקניתי עמודות מ- biobasic ולמרות שזה לא נועד להוראות כמו פרוטוקולים בסיסיים אלה, הם בהחלט זולים מספיק ויש לקחת אותם בחשבון בכיתה - הצבעות מסביב.
-1
בסוף דיברתי על מה שעושה כל שלב בהכנת הסיבוב וזה עובד בסדר. השיטות הישנות אינן קפדניות בהרבה כשמדברים על שינוי pH בזיקה על סיליקה וכו '
חָמֵשׁ תשובות:
#1
+7
Nick T
2011-12-15 05:09:02 UTC
view on stackexchange narkive permalink

הפרוטוקול בו השתמשתי במהלך מעבדת הגנטיקה שלי היה פירוק אלקליין ואחריו משקעים אתנוליים דומים לזה. שום דבר רעיל מאוד או שדורש מכסה אדים (לפחות בנפחים הקטנים המשמשים).

השיטה הפרקטית והמהימנה יותר היא להשתמש בערכת מיניפרפ (בדרך כלל עמודות סיבוב) מאחד מכמה ספקים ( Qiagen, Promega, Bio-Rad, וכו ') במחירים סבירים למדי במחיר של 1-2 דולר להכנה.

אם אני זוכר נכון, תמוגה אלקליין * היא * השיטה הבסיסית שמאחורי ערכות טיהור ה- DNA של קיגן (מיניפרה וכו '). עם עמודות הסיבוב מהערכה, אתה יכול לחתוך את משקעי האלכוהול ואת הייבוש. אולי לא נשמע כמו הרבה, אבל זה שווה את מחיר הערכה כי זה מבטל יותר מ 10 דקות וצעד רגיש מהפרוטוקול. שני הסנטים שלי: אתה לא רוצה להשתמש בפנול בכיתה.
כל ערכות ההכנה שהשתמשתי בהן (Qiagen, Promega, Invitrogen) אכן משתמשות בפירוק אלקליין. אני אוהב את העמודים רק בשביל שלא צריך לדאוג לאדות את כל האתנול לחלוטין (אני משתמש בהם עם סעפת ואקום אז אני מוצץ דקה או שתיים נוספות כדי לתת לכל זה להתאדות) או מחפש גלולה כלשהי חצי בלתי נראית .
מחבב את זה יותר ברגע שמצאתי את מתכוני הקיאג'ן על Open Wet Ware .. http://openwetware.org/wiki/Miniprep/Qiagen_kit גורם לי להרגיש טוב יותר להשתמש בו בשיעור.
#2
+6
yamad
2011-12-22 15:13:24 UTC
view on stackexchange narkive permalink

אני חושב שערכות עמודות הסיבוב הן הדרך. כפי שכבר הוזכר, היתרונות של הערכות הם בכך שהם קלים, בטוחים (והכי חשוב) כיצד כמעט כל מעבדה בפועל עושה טיהור פלסמיד בימינו.

הביקורת הגדולה ביותר על הערכות המסחריות היא שאתה יכול להסתדר בקלות מבלי לדעת כלום על מה שקורה בפועל בצינור. עם זאת, כפי שצוין בתגובות לתשובתו של ניק טי, אין ערכות קנייניות סודיות בערכות - הן משתמשות בשיטת תמוגה אלקליין . משמעות הדבר היא שאתה עדיין יכול ללמד את המנגנון בכיתה תוך כדי תועלת מעמודי הסיבוב.

אפשרות אחת, למטרות הוראה, היא להכין את כל הפתרונות שלך ורק להשתמש בעמודות הסיבוב תגובת שיקוע לאחר גלולת הקרום / חלבון המשקעים. בדרך זו, אתה מקבל את היתרון של התעקשות על שמות אמיתיים לפתרונות (NaOH הוא שם חינוכי יותר מ- P2) ואתה זוכה להשתמש בעמודות הספין במקום משקעי האתנול. אני מאמין שיש מקורות זולים שרק מוכרים את עמודות הספין, למרות שמעולם לא השתמשתי בהם. אתה רוצה להימנע ממשקעים באתנול מכיוון שהוא מוסיף פרוטוקול מינימום של 30 דקות (עבור הפרוטוקולים שלי זה היה יותר כמו 1.5 שעות ויותר). ולחכות לאתנול שיתאדה כדי שתוכלו להשהות מחדש זה כמו לראות צבע יבש, אלא אם כן יש לכם מהירות מהירה. על ידי הארכת שלב התנאי הסופי. אני חושב שההוראה הנתונה היא לתת למאגר ה- TE (טריס) "להתפנות" למשך דקה אחת לפני הסיבוב הסופי, אך באופן קבוע נתתי ל- TE לשבת במשך 15-30 דקות לפני שסובבתי למטה. ההבדל בתשואה פוצץ את החשיפה במצלמת הג'ל.

ישנם מקרים מסוימים בהם מיצוי פנול: כלורופורם עדיין רצוי, אך זה בהחלט לא אחד מהם. נהגתי לעשות P: Cs באופן שגרתי בעבודה עם RNA ו- DNA שמרים גנומי. מעולם לא ראיתי מישהו עושה דבר מלבד מיניפרפ בעת הכנת פלסמידים. יתרה מכך, הטרחה בעבודה במכסה אדים והסיכון לכוויות פנול עודדו אנשים רבים במעבדה להעדיף את ערכות הספין גם כאשר עובדים עם DNA גנומי.

אחרי קצת מאמץ עברנו לערכות הסיבוב ...
#3
+4
Reven
2011-12-15 05:52:23 UTC
view on stackexchange narkive permalink

מניסיוני, שיטת ה- P: C: I תביא לך תשואות גבוהות יותר והיא מעט יותר פשוטה (בצעדים ובכמויות המעורבות), אך כפי שאמר @Mad Scientist, השימוש בפנול עשוי להיות בעיה. זה תלוי בגיל התלמידים שלך.

זה לא רק גיל התלמידים, זה תלוי גם במתקנים הזמינים. אתה צריך למשל מכסה מנוע, ואתה צריך שיהיה שירות זמין לסילוק פנול.
פנול וכלורופורם רעילים מאוד ומסרטנים ובהחלט אינם אמורים לשמש סטודנטים או מחוץ למנדף תקין.
#4
+4
user91
2011-12-15 06:47:21 UTC
view on stackexchange narkive permalink

באמצעות עמודות ספין, פרופסור שלי ואני חילצנו ~ 30 פלסמידים מתוך ~ 30 דגימות תוך כמה שעות. זה קל, זול, והוא מניב פלסמיד באיכות טובה. המדגם שלי נכמת על ידי מפרט UV והוא היה בערך 200 ng / ul.

#5
  0
George
2014-02-01 08:25:24 UTC
view on stackexchange narkive permalink

כדי לחסוך בעלויות, אתה יכול לקנות עמודות ספין לבד מספקים כמו Syd Labs ( http://www.sydlabs.com/spin-column-for-plasmid-miniprep-p110.htm ) ולהכין מאגרים תוצרת בית. הספקים מספקים בדרך כלל את מתכון החיץ.



שאלה ותשובה זו תורגמה אוטומטית מהשפה האנגלית.התוכן המקורי זמין ב- stackexchange, ואנו מודים לו על רישיון cc by-sa 3.0 עליו הוא מופץ.
Loading...