שְׁאֵלָה:
מה קובע ביטוי מוצלח של חלבון ב- E. coli?
Gergana Vandova
2011-12-17 01:54:43 UTC
view on stackexchange narkive permalink

חלבונים מסוימים מתבטאים היטב במארח הטרולוגי; אחרים- לא. ידועות כמה דרישות לקביעת ביטוי החלבון, כמו מקדם חזק (כמו T7) לתעתיק ואתר קשירת ריבוזום חזק לתרגום. אני עובד עם חלבון, שמורכב משתי יחידות משנה - אלפא ובטא. שניהם נמצאים על פלסמיד עם מקדם T7 מול יחידת המשנה בטא (כלומר המבנה הוא מקדם T7, CDS עבור יחידת משנה בטא, CDS עבור יחידת המשנה אלפא). יחידת המשנה בטא מתבטאת היטב, אך האלפא לא. האם אתה קשור לכך שזה קשור לסביבה המקומית (מקדמים, RBS וכו ') וכמה זה תלוי בזה? כיצד אוכל להגביר את ביטוי החלבון?

היבטים מסוימים לא לגמרי ברורים לי. שתי יחידות המשנה באות לידי ביטוי על פלסמידים נפרדים, או? והכל בפלסמידים זהה למעט רצף החלבונים בפועל?
שתי יחידות המשנה נמצאות על אותו פלסמיד. רצף הפלסמיד מתחיל עם מקדם T7, RBS1, יחידת בטא, RBS2, אלפא יחידת משנה. רצפי ה- RBS הם קצת שונים, אז חשבתי לעשות אותם זהים, אבל זה לא אמור להשפיע מאוד על ביטוי החלבון. (הם קרובים מאוד לרצף הקונצנזוס).
ארבע תשובות:
#1
+9
Mad Scientist
2011-12-17 02:31:16 UTC
view on stackexchange narkive permalink

היבט חשוב אחד בעת ביטוי חלבון מאורגניזם אחר ב- E. coli הוא ששימוש בקודונים של האורגניזם המקורי שונה ככל הנראה משימוש בקודון של E. coli המשמש לביטוי ( הטיה על שימוש בקודון).

למרות שהקוד הגנטי מנוון, לא כל הקודונים שווים. הם עשויים לקודד את אותה חומצת אמינו, אך אורגניזמים נוטים להעדיף קודונים ספציפיים על פני אחרים, ו- tRNAs עבור אותם קודונים נוטים להיות נוכחים בריכוזים שונים. כאשר יש לך עכשיו הרבה קודונים ברצף שלך שהם נדירים מאוד ב- E. coli, הביטוי יסבול מכיוון ש- tRNA לאותם קודונים אינו קיים בריכוזים מספיק גבוהים כדי לקיים את התרגום.

שם הן שתי דרכים לפצות על כך, או שתשיג את ה- E. coli שלך לייצר יותר מ- tRNAs הנדירים, או שאתה מייעל את הרצף שלך לשימוש בקודונים שונים. לפיתרון הראשון ניתן לקנות זני E. coli מסוימים המכילים פלסמידים המקודדים ל- tRNA נדירים ב- E. coli, אחד מאותם זנים הוא למשל. זן ה- Ros21 BL21.

לאופטימיזציה של השימוש בקודון ישנן מספר חברות שמציעות לסנתז רצפים ממוטבים. יש גם כלים זמינים ברשת, אבל אין לי ניסיון ישיר עם אותם.

האופטימיזציה גם לא קלה כמו פשוט להשתמש בקודון הנפוץ ביותר בכל פעם, הוכח כי אופטימיזציה של הקודונים כך שתתאים מהירות התרגום באורגניזם המקורי יכולה לשפר את תשואות הביטוי. עבור חלבונים מסוימים, אתרי השהיה במהלך התרגום עשויים להיות נחוצים כדי להבטיח קיפול תקין. אם החלבון לא מתקפל כהלכה הוא יושפל במהירות והתשואה שלך תפגע. זה מתואר במאמר "ביטוי החלבון ההטרולוגי משופר על ידי הרמוניזציה של תדרי השימוש בקודון של גן היעד לאלה של מארח הביטוי" מאת אנגוב ואח '.

תוכלו למצוא סקירה נאה על כל הנושא במאמר "אתה אחד בגוגל - אופטימיזציה של גנים לביטוי חלבונים" מאת וולשית ואח '.

תודה, מדען מטורף! כן, חשבתי על אופטימיזציה של קודונים וזה בהחלט ברשימת המטלות שלי. סליחה ששכחתי להזכיר את זה. ל- DNA 2.0 יש תוכנה שתמיר את הרצף שלך לאופטימיזציה. שמעתי גם על רוזטה BL21, אך מעולם לא השתמשתי בה. אולי נרצה להיצמד למתח שלנו, כי זה המפיק ההטרולוגי של או סם שמעניין. אני קצת מודאג מאופטימיזציה של קודונים, בדיוק בגלל קיפול שגוי, אבל אני חושב שאנחנו צריכים לעשות את זה.
אבל זה עדיין לא מסביר מדוע תת היחידה השנייה מבטאת טוב יותר, כמו גם חלבונים אחרים מאותו אורגניזם מקומי באים לידי ביטוי היטב ב- E. coli. לכן אני חושב שזו יותר שאלה לגבי מרכיבי הבקרה של תמלול ותרגום, ולא על שימוש בקודונים נדירים.
@GerganaVandova עליכם להשוות את השימוש בקודונים של יחידת המשנה שלכם, יתכן שבמקרה אחד משתמשים בקודונים נדירים יותר מהשני.
אני משתתף בהרצאה של קלייס גוסטפסון מ- DNA2.0 - ואני מניח שכבר ידענו זאת - ששימוש בקודונים מועיל, אך לא תמיד עובד. יש להם שיטה קניינית שהיא אמינה יותר ...
#2
+6
Amy
2011-12-22 05:41:32 UTC
view on stackexchange narkive permalink

האם ניסית לשים את שני הגנים שלך על שני פלסמידים נפרדים (עם מקורות שונים של שכפול ובחירה אנטיביוטית, כמובן) ולבטא בצורה כזו? אם הראשונה מבין שתי יחידות המשנה מתבטאת היטב והשנייה לא, זה כנראה בגלל שהריבוזומים נופלים מה- mRNA לפני תמלול מלא של הגן השני. האם הגנים מקורם באאוקריוטים? אני חושב שקשה "להערים" על ריבוזומים של E. coli להתייחס לרצפים הטרולוגיים כאל אופרון, אבל אולי מישהו עם ידע רב יותר בתרגום פרוקריוטי יכול לעזור.

למעשה, רק הוספת מקדם T7 שני מקדימה. של גן 2 כנראה יעזור לא מעט:

גנים מועתקים בין מקדמים בודדים ובין אם מקדם יחיד, מה שמוביל ל- mRNA פוליסיסטרוני ארוך. דווח כי ביטוי פוליציסטריוני מוביל לביטוי נמוך יותר של החלבון המקודד במורד הזרם, הניתן לניצול כדי להשפיע על הסטואיומטריה של קומפלקס חלבון (9). דווח על ביטוי גבוה פי כמה עם מקדמים בודדים בהשוואה לתעתיק פוליצסטרוני (10). ( מקור)

אני אכן יודע מניסיון אישי כי ביטוי משותף באמצעות שני פלסמידים יכול לעבוד טוב מאוד עם הגנים הנכונים!

תודה על תשובתך. אני אוהב את הרעיון להוסיף מקדם T7 נוסף, אם כי רצפים חוזרים עלולים להוביל לבעיות עתידיות אחרות (אני לא רוצה לפרט). אבל אני עובד עם גנים שגודל גדול פי 3 ומקדם אחד לשתי יחידות היחידה עובד טוב. אולי זה מאוד ספציפי לרצף.
#3
+2
Nick T
2011-12-17 11:19:41 UTC
view on stackexchange narkive permalink

מדען מטורף כיסה נושאים פוטנציאליים עם הטיה בקודון (שניתן לשפר אותם עם רוזטות), אך באופן כללי יותר, ראיתי שונות עצומה בשיעורי הביטוי בין וקטורים שונים (pET-28 לעומת pET-24) ללא שום סיבה נראית לעין. המעבדה שלנו זכתה להצלחה אדירה עם וקטורים הנגרמים על ידי IPTG (עברו מ- pBC-SK ל- pET-24 ביטוי מוגבר פי 50).

מעבר לביטוי, החלבון יכול ללכת לאיבוד בעת הכנת התמצית ללא תאים. יתכן שזה לא נמצא בגדר התא אם הוא מיוצא באדיבות פפטיד אות, או שהוא זורק לגלולת ה"פסולת "בעת סיבוב תאים משופעים אם הוא מסיס בצורה גרועה. שמעתי תיאוריה לפיה בעיות מסיסות עשויות להיות מוגזמות על ידי וקטורים הרווים את מכונות הייצוא, שיכולים גם לעכב סינתזה ו / או להיות כה יעילים שהם פשוט גורמים למשקעים. ה מערכת ידנית של pet pet מציעה זמן ביטוי ארוך יותר (בן לילה) בטמפרטורה נמוכה יותר (15-20 מעלות צלזיוס) יכול לסייע בבעיות מסיסות. תהיה הסיבה אשר תהיה, הנדסת פפטיד האות הגדילה באופן דרסטי את הביטוי עבור רבים מהחלבונים שלנו.

#4
+2
Gergana Vandova
2012-01-07 01:15:01 UTC
view on stackexchange narkive permalink

מצאתי מאמר נחמד מאוד: תכנון גנים לביטוי חלבונים מוצלח, המכסה את מרבית הגורמים הקובעים את ביטוי החלבון. אני מפרסם חלקים ממנו, כי אני בטוח שזה יועיל לחלק מכם.

ניתן לשלוט בתרגום ברמת התחלה והתארכות. ייזום התרגום תלוי בעיקר ברצף של אתר קשירת הריבוזום (RBS) ומבנה משני mRNA מוקדם. גורמים אחרים לביטוי חלבון פחות מובנים אך חזקים באותה מידה.

1. ייזום תרגום

מרכיב מרכזי המשפיע על התחלת תרגום בפרוקריוטים הוא ה- RBS המתרחש בין 5 ל -15 בסיסים במעלה הזרם של מסגרת הקריאה הפתוחה (ORF) AUG התחל קודון. קשירת הריבוזום לרצף Shine – Dalgarno (SD) בתוך ה- RBS ממקמת את הריבוזום לקודון החניכה ... זיקה של RBS לריבוזום הוא גורם קריטי השולט ביעילות שבה חדש שרשראות פוליפפטיד יזומות. אינטראקציה זו מתחרה באינטראקציות אפשריות של זיווג בסיסים המעורבים באזור RBS העלולים להיווצר בתוך ה- mRNA עצמו. לפיכך, רצפי SD עם זיווג בסיס חלש יותר לריבוזום רגישים יותר להפרעות ממבנה ה- mRNA. עם זאת, כמה ניסויים מצביעים על כך שרצפי SD בעלי זיקה חזקה מדי עלולים להיות מזיקים, במיוחד בהורדת טמפרטורות, על ידי השבתה של התארכות ראשונית. קריטי הוא גם שהמרחק בין ה- RBS לקודון ההתחלה עם 5-7 בסיסים מהקונצנזוס SD AGGAGG שהוא אופטימלי.

שורות ראיות רבות מצביעות על כך ש קודונים הראשונים של 15–25 של ה- ORF ראויים לשיקול מיוחד באופטימיזציה של גנים. מחקרים הראו כי ההשפעה של קודונים נדירים על קצב התרגום חזקה במיוחד בקודונים הראשונים הללו, לביטוי הן בקולי Escherichia והן ב- Saccharomyces cerevisiae. ב- E. coli נראה כי נשירה של פפטידיל-tRNA במהלך התרגום של הקודונים הראשוניים מודגשת על ידי נוכחותם של קודונים נדירים של NGG. נראה כי השפעות אלה אינן תלויות במבנה משני mRNA מקומי. נכון גם שהביטוי עשוי להתאושש על ידי החלפת רצף של 5 'אפילו עבור רצפים שאינם מראים מבנה mRNA חזק במיוחד או מכילים קודונים נדירים או אלמנטים מזיקים ברורים אחרים באזור זה.

2. הטיה של קודון

הדרך השנייה בה ניתן להשתמש בתדרי קודון מארחים היא להתאים את תדרי קודון המארח בגן המעוצב. ניתן לעשות זאת פשוט על ידי בחירת כל קודון עם הסתברות התואמת את תדר הקודון המארח ... באמצעות קבוצות של גנים מגוונים בתכונות עיצוב גנים, Welch et al. מצא כי וריאציה בתדרי השימוש בקודונים נרדפים השפיעה עמוקות על כמות החלבון המיוצר ב- E. coli, ללא תלות בהשפעות רצף מקומיות של 5 '. וריאציה של לפחות שני סדרי גודל בביטוי נראתה עקב החלפה מעבר ל 15 הקודונים הראשוניים של ה- ORF. וריאציה זו הייתה בקורלציה מתואמת עם תדרי השימוש בקודונים העולמיים של הגנים, אם כי תדרי הקודון שנמצאו בגרסאות הבאות הגבוהות ביותר לא התאימו לאלה שנמצאו בגנום או בגנים אנדוגניים בעלי ביטוי גבוה של E. coli. ניתוח רב משתני הראה כי התדרים של קודונים ספציפיים עבור שש חומצות אמינו יכולים לחזות את ההבדלים שנצפו בביטוי. לא ברור מה הבסיס הביוכימי למתאם זה.

3. מבנה ה- mRNA והתארכות התרגום

אמנם עדויות רבות מצביעות על כך שמבנה ה- mRNA יכול להפריע ליזום התרגום הן בפרוקריוטים והן באאוקריוטים, אך השפעותיו של המבנה על התארכות אינן מובנות פחות. זה בחלקו יכול להיות בגלל פעילות הליקאזית פנימית של ריבוזומים, המאפשרת תרגום דרך סיכות שיער חזקות מאוד ועשויה למנוע מבנים רבים להגביל את קצב התרגום בפרוקריוטים או באיקריוטים. אולי יותר חשוב מכך, קשה לחזות את מבנה ה- mRNA, במיוחד עבור מסרים מתורגמים באופן פעיל שנמצאים בזרימה רציפה בין מצבים מקופלים ונפרשים שונים.

4. גורמים ספציפיים לחלבון המספקים מורכבות נוספת

החלבון עשוי להיות לא יציב במיוחד אצל המארח, במיוחד אם הוא מקופל בצורה גרועה עקב חוסר יציבות מובנה, היעדר גורמים תותבים מספיקים או שלאחר התרגום הלא תקין. שינוי ... ביטוי של חלבונים המופרשים וממברנה עשוי להיות מוגבל על ידי מנגנונים להפניית חלבונים אלה לקרום. ייתכן אפילו שרצף חומצות האמינו החלבוני עשוי להגביל את יעילות התרגום. לדוגמא, סבורים כי פרולין מתורגם לאט ב- E. coli, ללא קשר לאיזה קודון משתמשים.

ביטוי של החלבון עשוי להיות רעיל לתא המוביל לחוסר יציבות של וקטור הביטוי או דיכוי המארח של סינתזת החלבון ... אסטרטגיה נפוצה להפחתת רעילות היא הורדת הביטוי לרמות נסבלות. מקדמים מגוונים בכוחם יכולים להיות כלים יקרי ערך למציאת קצב ביטוי מיטבי לתשואה מקסימאלית ... אחת הדרכים הפוטנציאליות להימנע מרעילות של חלבונים מסוימים היא להפנות ביטוי לפריפלזמה או לתקשורת. זה יכול להיעשות על ידי מיזוג מסוף N של רצף אות הפרשה.

למידע נוסף, אנא קרא את כל המאמר. אני ממליץ לקרוא גם פרמטרים של עיצוב לשליטה בביטוי גנים סינתטיים ב- Escherichia coli.

תודה על הקישורים! השתמשתי ב- DNA 2.0 לאופטימיזציה של קודונים וסינתזת גנים בעבר והיו לי תוצאות טובות - אני בהחלט מעוניין לקרוא את הפרסומים שלהם.
@Amy: כן, חלק מהמאמר עוסק בתכונות של DNA2.0, מה שאני מוצא מאוד שימושי. אני משתמש חדש ועדיין מתרגל לתוכנה שלהם, אבל זה נראה די נחמד עד כה.


שאלה ותשובה זו תורגמה אוטומטית מהשפה האנגלית.התוכן המקורי זמין ב- stackexchange, ואנו מודים לו על רישיון cc by-sa 3.0 עליו הוא מופץ.
Loading...